Biofisica

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Bioscienze: rendere visibile, l’invisibile.

Tutto ciò che siamo e impariamo, e tutti i segni visibili che lasciamo sul mondo esterno sono dovuti a meccanismi invisibili che avvengono all’interno delle cellule. Una parte importante del lavoro del nostro laboratorio è dedicato alla visualizzazione di processi invisibili.

Uno strumento fondamentale nello svolgimento di questo esercizio viene dalla scoperta che una proteina isolata dalla medusa Victoria aequorea può essere tradotta nella sua forma perfettamente funzionale in qualsiasi cellula di vertebrati. La seconda proprietà straordinaria di questa proteina è che, quando viene illuminata di luce azzurra restituisce parte della energia assorbita sottoforma di luce verde: questa proteina è fluorescente, da cui il nome, Green Fluorescent Protein (GFP).

Vi sono molti modi in cui le proteine fluorescenti possono essere utilizzate per illuminare i processi cellulari. Per esempio, il DNA di questa proteina può essere fuso con il DNA di una proteina bersaglio. Il gene risultante dalla fusione di questi due geni esprime una proteina che conserva le proprietà della molecola originale e inoltre diventa visibile. Se in risposta a stimoli extracellulari, la proteina modifica la sua localizzazione intracellulare, questo processo può essere visualizzato in cellule vive (figura 1).

In questi anni abbiamo usato le proteine e coloranti fluorescenti per visualizzare una grande varietà di processi biologici, in diversi modelli sperimentali che vanno dalla cellula in cultura fino al cervello intatto.

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Figura 1. La GFP è stata fusa con ERK2, una proteina fondamentale per controllare differenziamento e proliferazione cellulare. Nei neuroni, che sono cellule non proliferanti, questa proteina è uno dei controllori molecolari fondamentali della plasticità sinaptica e della memoria. ERK2 è attivata da stimoli extracellulari e dalla attività sinaptica: per compiere le sue funzioni ERK2 attivata da uno stimolo, deve traslocare nel nucleo cellulare. In questo esperimento le cellule sono state stimolate chimicamente con un fattore di crescita. Inizialmente ERK2 è localizzata principalmente nel citoplasma ed il nucleo è relativamente vuoto (pannello di sinistra). 3 minuti dopo stimolazione la proteina inizia a traslocare nel nucleo (secondo pannello) e in un minuto diventa visibile la drastica redistribuzione subcellulare (terzo pannello, 4’ dallo stimolo) che si completa entro 10 minuti (pannello di destra; Costa et al. 2006).

 

Ma questa Cellula è sana o malata?

Il mosaicismo genetico è una condizione in cui cellule che dovrebbero essere identiche esprimono invece due differenti genomi. Ci sono molti esempi di questa situazione che è spesso associata a gravi patologie. Siamo interessati a studiare le conseguenze funzionali di un caso paradigmatico di mosaicismo: la sindrome di Rett. Questa è una malattia gravissima che si manifesta in bambine normali all’età di circa due anni. La comparsa della malattia è caratterizzata da regressione, perdita del linguaggio, difficoltà motore e sviluppo di un fenotipo autistico. Spesso è accompagnata da crisi epilettiche difficilmente curabili. Nella grandissima maggioranza dei casi, la malattia è causata dalla mutazione del gene MeCP2, un controllore della espressione genica. Questo gene è posto sul cromosoma X, di conseguenza i maschi, che hanno un solo cromosoma X, se sono portatori della mutazione, sono omozigoti, ovvero non hanno nessuna copia del gene funzionante e ciò porta alla morte del bambino prima del parto o immediatamente dopo. Nelle femmine, vi sono due copie del gene poste sui due cromosomi X: una mutata ed una normale. A causa di un fenomeno che opera solo sul cromosoma X, una coppia del cromosoma è inattivata e quindi l’intero organismo è formato da un mosaico di cellule che esprimono MeCP2 mutato o normale.

Per capire i meccanismi cellulari causati dalla mutazione nelle cellule “malate” e per capire le conseguenze delle mutazioni sulle cellule “sane” ma frammiste a quelle mutate, è necessario usare degli strumenti di indagine che permettano di studiare le proprietà funzionali della cellula singola ed è inoltre essenziale essere in grado di riconoscere le cellule che portano la mutazione.

Screen Shot 2014-02-11 at 15.18.56-1 Figura 2. Sezione di corteccia di topo in cui è stato inserito il sensore Beatrix. I neuroni rossi hanno un genotipo normale mentre i neuroni verdi esprimono la mutazione.

Stiamo sviluppando un sensore fluorescente (Beatrix) che permette di rendere distinguibili le cellule normali da quelle che portano la mutazione. Il trucco che utilizziamo è nascondere la mutazione all’interno di due particolari sequenze di DNA chiamate Lox. La mutazione è invisibile a meno che venga smascherata dall’azione di un enzima specifico, la CRE-ricombinasi, che riconosce le sequenze ed esegue la mutazione richiesta. Il gene che codifica Beatrix, è formato dalla unione dei geni codificanti una proteina rossa ed una verde. All’interno di questo DNA sono inseriti due siti Lox in modo tale che la cellula esprime la proteina rossa o verde a seconda se il gene è stato ricombinato dalla CRE. Di conseguenza, quando si ha l’attivazione della CRE ricombinasi, la mutazione è smascherata ed allo stesso tempo la cellula cambia colore (figura 2; vedi il link seguente per ulteriori dettagli http://www.nano.cnr.it/index.php?mod=men&id=220).

 

Visualizzare forma e funzione nel cervello

La microscopia a due fotoni è una tecnica potentissima che permette di visualizzare la fluorescenza prodotta da cellule poste all’interno di un organo in vivo. In particolare, negli ultimi 20 anni questa tecnica ha totalmente rivoluzionato la comprensione del cervello, di come si sviluppa e di come avvengono i processi di apprendimento. Funzione e forma delle cellule nervose possono essere studiate mediante molecole fluorescenti che, come per l’esempio di Beatrix, permettono di riconoscere il genotipo della cellula e la sua struttura fine. Altre molecole sono ingegnerizzate in modo tale che la fluorescenza emessa fornisca informazioni su parametri fisiologici presenti nella cellula, come, per esempio, il potenziale di membrana oppure la concentrazione ionica. Questi strumenti uniti alla esistenza di modelli murini di malattie genetiche, aprono una finestra straordinaria sui meccanismi alla base del funzionamento fisiologico e patologico del cervello (figura 3)

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Figura 3. Anatomia funzionale nella corteccia cerebrale in un topo autistico. A,B) Alcuni neuroni sono marcati dalla protein GFP e possono essere osservati al microscopio a due fotoni. C) In queste immagini ad elevato ingrandimento si possono osservare delle piccole strutture che protudono dai dendriti delle cellule nervose. Queste strutture sono le spine dendritiche e sono i siti dove si formano le sinapsi, i luoghi di contatto elettrochimico tra neuroni ed il sito principale dove avvengono i fenomeni di apprendimento. Le spine dendritiche sono dotate di un elevato grado di plasticità strutturale in epoca giovanile, e questa plasticità riflette la grande capacità di apprendimento tipica della età giovanile. Al contrario, le spine dendritiche nel topo autistico sono molto stabili, indicando una prematura chiusura del periodo di pronunciata plasticità, come mostrato dalla quantificazione mostrata in D).

 La fluorescenza può essere usata per misurare parametri funzionali delle cellule. In questi esperimenti, neuroni ed astrociti sono stati caricati con un colorante la cui fluorescenza è proporzionale alla concentrazione del calcio intracellulare. In figura 4A è mostrata una immagine ottenuta dalla corteccia visiva del topo: sono presenti neuroni (in verde) ed astrociti (in rosso). Questa immagine fa parte di una sequenza temporale nella quale i cambiamenti di Calcio intracellulare sono tradotti in cambiamenti di luminosità delle cellule. I tracciati a destra mostrano l’evoluzione del Calcio intracellulare durante attività sinaptica patologica (attività epilettiforme).

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Figura 4. Imaging del Calcio in corteccia visiva. A) Le cellule della corteccia sonos tate colorate con un colorante verde la cui fluorescenza aumenta all’aumentare del Calcio intracellulare. Gli astrociti hanno anche internalizzato un colorante specifico rosso. B,C) Attività di neuroni ed astrociti durante la stimolazione visiva.

In B è invece mostrato un campo durante un esperimento in cui al topo viene mostrato uno stimolo visivo complesso. Nel pannello sottostante sono mostrate alcune tracce indicanti i cambiamenti di calcio intracellulare che mostrano come neuroni diversi rispondano in modo diverso allo stimolo. In questo esperimento, gli stimoli sono formati da barre luminose che scorrono sullo schermo con un certo orientamento. Cellule diverse rispondo a orientamenti diversi come indicato in C, dove ogni diagramma polare moltra l’ampiezza della risposta in funzione dell’orientamento dello stimolo.